亚克隆

✍ dations ◷ 2025-08-01 05:15:19 #亚克隆

亚克隆（英语：Subcloning）是一种分子生物学技术。该技术旨在将目的片段（基因、启动子等）导入目标载体中，以进行进一步研究。

目前，亚克隆的传统方法主要基于两项技术：PCR技术和限制性核酸内切酶（限制酶）酶切。除此以外，一项较新的亚克隆技术也已出现，即Infusion。该技术相比基于PCR和酶切的传统方法具有操作简便、快速等优点，可以实现传统方法难以做到的亚克隆。

首先，使用限制酶将目的基因切下。切下来的目的基因需经过纯化（常用手法是胶回收（英语：Gel extraction））。之后，可以通过PCR来制造一定数量的该目的基因的拷贝。

同时，需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体，以让载体产生与目的基因互补的黏性末端，以使得它们能在后续步骤中被DNA连接酶连接。磷酸酯酶（通常是小牛肠道碱性磷酸酶（英语：Calf-intestinal alkaline phosphatase）（CIAP））在该过程中也必不可少，因为它能去除DNA链5'端的磷酸基团，防止载体的自身黏合。形成的目的载体带有两个缺口，在转化入感受态细菌后能被感受态细菌自行修复。之后，再对目标载体进行分离/纯化。

接下来，将目的基因与载体混合，并添加DNA连接酶。通常，目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1（也有文献认为应为3比1）。目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。另外，目的基因也不应过长。超过10kb（千碱基对）的话，目的基因将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上，让反应进行一整晚。

利用亚克隆技术，可以将目的基因导入目标载体中，进行进一步研究。比如，如果想要研究某基因在大肠杆菌中的作用，就可以将该载体导入成熟的大肠杆菌表达载体中（如pUC9），便于后续研究的进行。如果想要研究某启动子的控制作用，也可以将之插入特定的载体中，再进行进一步研究:237-239。

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