亚克隆

✍ dations ◷ 2025-10-22 08:17:25 #亚克隆

亚克隆(英语:Subcloning)是一种分子生物学技术。该技术旨在将目的片段(基因、启动子等)导入目标载体中,以进行进一步研究。

目前,亚克隆的传统方法主要基于两项技术:PCR技术和限制性核酸内切酶(限制酶)酶切。除此以外,一项较新的亚克隆技术也已出现,即Infusion。该技术相比基于PCR和酶切的传统方法具有操作简便、快速等优点,可以实现传统方法难以做到的亚克隆。

首先,使用限制酶将目的基因切下。切下来的目的基因需经过纯化(常用手法是胶回收(英语:Gel extraction))。之后,可以通过PCR来制造一定数量的该目的基因的拷贝。

同时,需要用切割目的基因的那种限制酶切割载体,以让载体产生与目的基因互补的黏性末端,以使得它们能在后续步骤中被DNA连接酶连接。磷酸酯酶(通常是小牛肠道碱性磷酸酶(英语:Calf-intestinal alkaline phosphatase)(CIAP))在该过程中也必不可少,因为它能去除DNA链5'端的磷酸基团,防止载体的自身黏合。形成的目的载体带有两个缺口,在转化入感受态细菌后能被感受态细菌自行修复。之后,再对目标载体进行分离/纯化。

接下来,将目的基因与载体混合,并添加DNA连接酶。通常,目的基因和载体的分子数之比设定为5比1或10比1(也有文献认为应为3比1)。目的基因与载体的数量过量都会造成不利影响。另外,目的基因也不应过长。超过10kb(千碱基对)的话,目的基因将难以和载体有效结合。一般操作人员会把反应容器放在冰上,让反应进行一整晚。

利用亚克隆技术,可以将目的基因导入目标载体中,进行进一步研究。比如,如果想要研究某基因在大肠杆菌中的作用,就可以将该载体导入成熟的大肠杆菌表达载体中(如pUC9),便于后续研究的进行。如果想要研究某启动子的控制作用,也可以将之插入特定的载体中,再进行进一步研究:237-239。

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