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埃德曼降解法
✍ dations ◷ 2025-04-04 06:47:16 #埃德曼降解法
Edman降解(埃德曼降解,英语:Edman degradation),也根据所使用试剂而被称为“PTC法”或“PTH法”,是肽链或蛋白质中N-端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔·埃德曼(Pehr Edman)首先创立。用异硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate, 缩写:PITC)与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应,生成苯氨基硫代甲酰胺(PTC)的衍生物,然后用酸处理,关环,肽链N-端被选择性地切断,得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来,酸作用下,该衍生物不稳定,会继续反应,形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲(PTH)衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲(PTH-氨基酸),可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次,结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽,剩下的肽链可以进入下一个循环,继续发生降解。在1967年就出现了实现根据此原理设计的自动化仪器。利用自动分析仪进行分析时,能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列,最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下,每形成一次PTH-氨基酸,效率可保持在99%以上。而且此法用量少,一般只用10-100皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。对于肽链较长的多肽,可以先将肽链切断成多个小肽,对这些小肽进行氨基酸分析,然后将这些信息拼接起来,得到起始肽链中的氨基酸序列。由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的,因此当N-端被其他化学基团所封闭时,就需要先去除这些基团,然后才能进行测序。此外,蛋白质中含有半胱氨酸残基时,有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下,需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H,然后才能用Edman降解测定序列。另外,由于所有反应都在封闭或体外的环境之下,势必会达到平衡,因此若在第一个试管里加入PITC,它会和试管内的第一个氨基酸的N-端氨基结合,可是由于平衡原理:PITC + 一段氨基酸序列 = PITC-氨基酸 + 少了第一个氨基酸的氨基酸序列,因此在第一个试管里会同时存在没有结合PITC和有结合PITC的氨基酸序列,这会导致我们将第一管有PITC-氨基酸的物质分离后,继续在第二个试管里加入PITC,则此时第二个试管里会含有少量的PITC-氨基酸(1)和多量的PITC-氨基酸(2)。这时候我们可以利用联用质谱法(Tandem mass spectrometry)等技术来分析,若分析后发现量多者为PITC-氨基酸(2),量少者则为PITC-氨基酸(1),因此我们就解决了反应不完全的问题。而另外一个问题也随之衍生,一旦我们不停地重复此步骤,得到氨基酸的序列时,一直到约第50个试管开始,就会发现所以氨基酸的量经分析后都会变得几乎一样,这样我们就没有办法可以知道氨基酸的序列。这也就是为什么我们需要先将一段大于50个氨基酸的序列用水解酶给进行切割,让所有片段的氨基酸序列小于50,这样我们才可以得到比较准确的氨基酸序列。
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