在生物化学中,去磷酸化(英语:dephosphorylation)或称脱磷酸化是一种通过水解从有机化合物中去除磷酸基团(PO43−)的化学反应。这是可逆的后转译修饰。去磷酸化及与其对应的磷酸化作用是通过分离或接上磷酸酯和酸酐来使酶活化及去活化。常见的去磷酸化作用如ATP转化为ADP和无机磷酸盐。
去磷酸化使用水解酶来使酯键裂解。去磷酸化中使用的主要水解酶亚类是磷酸酶,它通过将磷酸单酯水解成磷酸根离子和带有游离羟基(-OH)的分子来去除磷酸基团。
可逆的磷酸化-去磷酸化反应发生在每个生理过程中,从而使有机体生存所必需的蛋白质磷酸酶发挥适当的功能。由于蛋白质的去磷酸化是细胞信号转导的关键过程,因此蛋白质磷酸酶与心脏病、糖尿病和阿兹海默症等疾病有关。