多肽合成

多肽合成（英语：Peptide synthesis）为有机化学中多肽的合成过程，多肽是由多个氨基酸借由肽键连接起来的有机化合物。在生物中，合成长型多肽（蛋白质）的过程，称作蛋白质生物合成。液相多肽合成（Liquid-phase peptide synthesis）是一种多肽合成的经典方法。虽然现在大多数在实验室中已经被固相多肽合成（见下文）所取代，但液相多肽合成仍有在工业上大规模生产多肽的可用性。固相多肽合成（Solid-phase peptide synthesis，SPPS），由罗伯特·布鲁斯·梅里菲尔德（Robert Bruce Merrifield）首创后， 便成为多肽合成的模范。现在已成为被公认在实验室中制造多肽和蛋白质的有机合成方法。固相多肽合成能够合成在细菌中难以表现的自然多肽、加入非自然氨基酸、修饰多肽/蛋白骨架、合成拥有D构型的蛋白。其做法利用多孔性且不溶的珠状固体在可构成肽链的部分加上带有功能单元体（连接体），多肽将会以共价键连接珠状固体直到加入无水的氟化氢或三氟乙酸溶剂将其切断为止，因此多肽可以固定在固相并在过滤时可被保留下来，副产物和溶剂则会通过过滤器。一般来说固相多肽合成的流程为：偶合-冲洗-去除保护-冲洗 为一循环；固相多肽上游离的N端和N端被保护的单一氨基酸单元偶合，然后这个单元会被脱去保护，再度露出新的N端使反应接续下去。这项技术的优点在于每个反应后冲洗循环的能力和去除带有和树脂共价结合之尚未合成完多肽的溶剂的能力。其中最重要的考虑因素是每个步骤的收率，如果每个步骤收率都不高，那最后总体反应收率就会变得极差，也因此每个氨基酸必须要加超过量(二到十倍)，才能优化整体反应的产量。 两种较常用的固相多肽合成为Fmoc和Boc。固相多肽合成与核糖体的蛋白质合成不同，方向是由C端往N端合成，而N端的氨基酸单体就是被Fmoc和Boc这两种基团加入多肽之未保护氨基酸单体保护的。自动化合成器也可用于两种技术，但许多研究小组继续手动进行固相多肽合成。固相多肽合成的收率有限，而且产出的多肽或蛋白质也只局限在70个氨基酸单体以内。合成的难度是属于序列依赖性，要合成典型的类淀粉蛋白多肽和蛋白质也是有困难的。如果要合成更长的多肽就必须透过自然化学连接（英语：native chemical ligation）的方式连接两段多肽在定量的收率下。固相多肽合成推出以达40年以上，技术上也有显著的优化：第一，使用树脂上的优化。 第二，C端的氨基酸和聚苯乙烯树脂之间的连接体附着和裂解上在大致上定量产率下的改善。 第三，侧链保护上的演进，使不是目标物的侧链反应受到限制。第四，对输入的氨基酸的羧基基团的新活化基团有所改善，改善偶合和减少差向异构体。最后，过程本身已被优化。在梅里菲尔德初次报告时，脱去保护的α-氨基导致了肽和树脂形成复合盐类，使得在偶合之前需先用碱中和。另外在多肽的氨基酸单体与下一个氨基酸单体结合的时候，多肽可能聚集并形成二级结构，对偶合产生不利的影响。Kent等人的研究显示，中和α-氨基与下一个氨基酸的偶合能够改善的偶合。1975年，Castro等人首次使用BOP reagent（英语：BOP reagent）。固相载体（Solid supports）这个名称，由字面上来看意味着反应皆进行在载体表面，但其实并非如此而已，固相载体也能够在粒子内反应，因此固相载体这个名称更能将聚合物的不溶性表现得淋漓尽致。 固相载体的物理性质、应用方式、载体结构的物质变化以及交联的数量，都是经常拿来结合使用的。 许多研究此领域的科学家相信，载体能够利用最少的交联次数来赋予本身的稳定性，同时赋予固相多肽合成反应进行良好的溶剂化系统。然而，一个高效率的固相载体包含以下四点：以下为主要的固相载体形式：聚苯乙烯树脂是由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联所产生的。这个物质在固相肽合成（SPPS）中是最常见的固体载体，此论点是由R. Bruce Merrifield率先提出了这个想法。 聚苯乙烯树脂是一种多用途树脂，由于在二氯甲烷中能达到最小膨胀，因此在多孔版盘的自动肽合成都是相当实用。最先提出此想法的R. Bruce Merrifield 当时用了2％的二乙烯基苯和聚苯乙烯进行交联。此研究产物也被称作梅里菲尔德树脂（Merrifield resin）。此研究方法产生了像是二氯甲烷的溶剂化的非极性溶剂疏水珠。在那之后, 新型树脂伴随着以下特点被开发出来：高度交联的（50％）聚苯乙烯已开发到具有增加机械稳定性的特点，并被当做更好的过滤试剂和溶剂，以及快速反应动力的物质。聚酰胺树脂也是一个相当有用亦是常见的树脂, 实验中可以看出聚酰胺树脂能够膨胀的比聚苯乙烯更大,因此在某些情况下，可能不适合于做自动合成，像是孔洞太小等等状况。聚乙二醇（PEG），也称为聚(环氧乙烷)（PEO）或聚氧乙烯（POE），是指环氧乙烷的寡聚物或聚合物。这三个名称现今一般为同义词，但历史上聚乙二醇往往是指分子质量低于20,000 g/mol的低聚物和聚合物，PEO是指分子量超过20,000的聚合物，POE则可指任何分子质量的聚合物。TentaGel树脂就是这种类型树脂最好的一个例子。此类型树脂主要的结构还是聚苯乙烯，其不同在于主链上附接着聚乙二醇（PEG;也称为聚环氧乙烷）的长链（分子量为约3000 Da）。合成反应进行在聚乙二醇（PEG）的前端能够让这个又长又难制造的肽在最适合的情况下制成。此外，混合型聚苯乙烯树脂对于合成组肽库以及树脂的筛选实验都是相当有利的。混合型聚苯乙烯树脂不会在合成反应中扩张过大，因此也常被拿来做机械性肽合成的树脂。ChemMatrix（R）是树脂制的新类型，它主要是由聚乙二醇（PEG）交联。 ChemMatrix（R）宣称有高化学稳定性和热稳定性(兼具微波合成)，相较于聚苯乙烯类树脂更能在高度膨胀的氰基甲烷、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、三氟乙酸(TFA)以及水表现出它的稳定性。ChemMatrix也在疏水性的序列中表现出对于合成显著的改善。由此可看出ChemMatrix也许能够对难于进行合成的长链有所帮助。 利用肽合成增强能量来改善固相载体，增强在脱去固相肽合成(SPPS)的过程中重复使用三氟乙酸(TFA)的负担。此外，不同的树脂生成不同官能团的C-末端，如同oxymethylphenylacetamidomethyl（PAM）树脂则生成一般的C-末端羧酸。 另一方面，paramethylbenzhydrylamine（pMBHA）树脂生成C-末端酰胺，这是一种用来模拟蛋白质的内部非常好用的东西。随着Fmoc SPPS的反应进行，许多不同的树脂也被创造出来，再以TFA去除。 像是Boc反应过程中，用两个主要的树脂生成一个C-末端羧酸或酰胺是否可行。王氏树脂是生成C-末端羧酸最常见的肽树脂。如果制造C-末端酰胺的策划是理想的，则Rink酰胺树脂的研究则是可行的。氨基酸能在N-末端和C-末端进行反应，因此有利于在合成过程中发生氨基酸的耦合。许多氨基酸也具有反应性支链的功能基团，合成过程中可以和自由末端或其他支链基团作用、肽键延长以及减低产量及纯度的影响。为了以最小的支链反应促进适当的氨基酸合成，化合物基团会选择特定的氨基酸基团以及片段，或者是从非特异性反应去保护整个官能基。这些保护基团，在这广阔的自然界可分为下列三组，如下：纯化的单氨基酸在合成反应之前皆会和这些保护基团作用，并在肽合成的特定步骤有选择性的除去不适当者。必须加入过量的氨基酸以确保能够在每一个合成步骤中完成偶联，如果没有N端保护基团则不会有保护的氨基酸聚合会发生，这将会导致低产率的肽或是合成上的失败。N末端保护基团需要附加步骤来除去保护基，以下为设计流程：目前有两种保护基团(t-Boc, Fmoc)在固相多肽合成反应是最常见的，他们的不稳定性通常是因氨基甲酸酯基团所引起，氨基甲酸酯基团很容易释放CO2，然而这却又是一个不可逆反应。此为最初实验最常用来合成蛋白质的方法(tert-butyloxycarbonyl可简写为 "Boc")，可用来保护的α氨基。在这个方法中，Boc基团利用共价结合在氨基上来抑制其亲核性。C-末端氨基酸通过连接子以共价的方式连接到树脂上，接下来Boc基团用酸除去，像是三氟乙酸（TFA）等等。这形成了一个带正电荷的氨基（在过量的TFA的存在下），中和（通过原位或者非原位方法）以及耦合到输入活化的氨基酸，整个反应通常会使用过量（两到四倍）的活化的氨基酸来驱动反应完成。在每个周期期间，每个脱去保护基和耦合的步骤，皆可用二甲基甲酰胺（DMF）洗涤后进行，以除去过量的试剂，亦可用高收率来进行（〜99％）。在合成过程中，t-Boc保护方式保留了有用的物质，并减少肽聚集。t-Boc保护基团可加入具有的t-Boc-酐和适当碱的氨基酸。有一些研究人员倾向于Boc 的SPPS复合成。此外，当在做合成碱相关的非天然肽类似物时（如缩酚酸肽），t-Boc保护基是必要的，因为Fmoc SPPS使用一个基去保护α氨基。永久支链保护基团是典型地【苯甲基】或【芐基】类基团。反应最终会去除联动肽，同时产生支链脱去保护与经由水解裂解的无水氟化氢。最终产品是一种氟化物盐，这个产物较为容易溶解。最重要的是，清除剂(如甲酚)添加到氟化氢，可以用来防止反应T-丁基阳离子产生非理想性的产物。事实上，使用刺激性氟化氢可能会降低一些肽的产率。在最终裂解情况下，无水氟化氢降解蛋白质的效果产生一个新的α氨基保护基团 ，Fmoc则是一个较温和的脱去保护方式。此方法是利用碱，通常哌啶（20-50％）在DMF中，以除去Fmoc基团，以暴露α氨基与进入的活化氨基酸反应。较不同于Boc的酸，在脱去保护时用的α氨基，FMOC SPPS则使用碱，进而接触胺的是中性的。因此，肽树脂中并不需要中合反应，除了缺乏肽之间静电排斥可以导致增加的聚集。因为游离的芴基是发色团，脱去保护通过Fmoc基可以通过自动合成UV吸光度的途径。Fmoc基的优点在于，它是在非常温和的碱性条件下（如哌啶）裂解，但在酸性条件下稳定，虽然在某些合成序列并不总是如此。这使得不稳定温和的酸保护基团在碱性条件下是稳定的，如BOC和芐基，被当做支链的目标肽氨基酸残基。这样的垂直保护基方法在有机化学合成中是很常见的。Fmoc优于BOC的原因在于Fmoc更容易裂解，然而他的原子经济性也较小，因为芴基比t-丁基大得多，相对的，价格上Fmoc氨基酸也是较高的，直到第一个大型引子合成肽药物产生为止。当市场需求调整了两套氨基酸的相对价格，于是在1990产生Enfuvirtide。半永久性的支链保护基是碱性的t-丁基，并在清除剂的存在下用TFA从树脂和除去永久保护基的蛋白质进行最终切割。清除剂通常是以1：1的比例的水和三异丙基硅烷（TIPS）来制成。然而Fmoc法是垂直于两个方向，任何α氨基的脱去保护作用，皆是从树脂的脱去保护支链基和最终裂解发生由独立的机制，所得最终产品是TFA盐类，Boc SPPS的制成相较之下是比氟化物盐难以溶解的，此方法比Boc法更温和，因为树脂步骤的脱保护/裂解是发生在不同条件，而不是具有不同的反应速率。人们看到，这两种方法具有优点和缺点，因此，有几个因素有助于确定哪些方法可以优先选择。 DMF必须是 (即小/无杂质)，也必须是”新鲜“。这是因为，DMF中经历光分解，以形成一氧化碳和二甲胺的事实。二甲胺可以除去Fmoc基团，会因此导致的杂质的产生。第一个使用（Z）基团作为保护基团的是马克斯贝格曼，他以此基团来合成寡肽。 另一个基团氨基甲酸酯基是芐氧基羰基（Z）基团。溴化氢/乙酸或催化氢化：它是在严苛的的情况脱去。现今，它几乎已经是用来做为支链的保护。烯丙氧基羰（ALLOC）保护基团通常用于保护羧酸、羟基或氨基的，它有时也可用于进行对树脂环肽的形成，其中所说的肽是由支链官能团连接到树脂上。该ALLOC基可以使用四（三苯基膦）钯（0）连同37：2：二氯甲烷1:1混合物，乙酸被除去，或著是和N-甲基吗啉（NMM）反应2小时。树脂必须在0.5％DIPEA的情况下，以及DMF中以3×10毫升的0.5％二乙基硫代氨基钠在DMF中仔细洗涤，然后再加入5×10毫升1：1的DCM：DMF。对于蛋白质微阵列的特殊应用，也就是一种用来光刻保护基团的物质。这些基团可以通过暴露于光而被除去。氨基酸支链代表了广泛范围的官能团，并且在非特异性反应的过程中达到肽合成点。正因为如此，需要许多不同的保护基团 ，通常是基于该芐基（BZL），T-丁基（TBU）基团。一个给定的肽合成过程中所用的特定保护基取决于肽序列和N-终端中使用的保护的类型。 支链保护基团是已知的永久性或半永久性保护基团，因为它们能够经受化学处理的多个循环合成过程中和肽合成完成后，用强酸处理过程中仅除去。因为在肽合成通常使用多个保护基团，这些基团必须是相容的，以允许不同的保护基的脱去保护的同时不影响其它保护基。因此保护方案建立到匹配的保护基团，使得一个保护基的脱去保护不会影响其他组的结合。因为N-末端脱去保护的过程中肽合成连续发生，保护方案才能建立，其中不同类型的支链保护基（BZL或TBU）Boc或Fmoc基，分别优化脱去保护。这些保护方案也包含在每个合成和切割的步骤中。用于耦合的多肽羧基通常会被激发，这对于加快整个反应是非常的重要。 以下为两种主要活化基团的类型： 碳化二亚胺和triazolols这两种，然而，使用五氟苯基酯（FDPP， PFPOH）和BOP-CL在制作环化肽时是很常见的。这类的活化剂第一次被开发。最常见的是二环己基碳（DCC）和二异丙基（DIC）。反应与羧酸产生一个高反应性的O型基异脲。在人工合成蛋白质（例如Fmoc固态合成），C-末端经常被用作在其上的氨基酸单体加入的附着位点。以增强羧酸基的电性，带负电荷的氧必须首先被“激发”变成更好的离去基团。 DCC就是用于此目的。带负电荷的氧将作为亲核试剂，攻击中的DCC中心碳。DCC暂时附着到前羧酸酯基（也就是现在的酯基），使得由氨基亲核攻击（在附着氨基酸），以先前的C末端（羰基）更有效。与碳二亚胺的问题是，它们太活泼，它们能因此导致racemizationof氨基酸。三唑是指分子式为C2H3N3，由2个碳原子和3个氮原子组成的一个五元杂环有机化合物。在多肽的情况下，因两个氮原子之间的相对位置不同，三唑有两种同分异构体为解决外消旋化的问题，就连三唑一起介绍进来。最重要的是1-羟基 - 苯并三唑（HOBT）和1-羟基-7-氮杂苯并三唑（HOAT）。他人已经开发出来。这些物质可与O-酰基脲反应以形成活性酯，以达到反应性较低和较少的消旋的危险。HOAT是因为相邻的群体效应 ，添加HOBt已经从许多化学供应商目录中删除。因为随着空运或海运的严格限制，HOBt可能有爆炸性的。替代的HOBt和HOAT也已经引入了。其中最有希望的是廉价的乙基-2-氰基-2-（羟基亚氨基）乙酸乙酯（商品名纯Oxyma），这些不是炸药，并且在HOBt和HOAT之间都具有一个适当的反应性。较新的发展省略碳化二亚胺完全。活性酯被引入作为非亲核阴离子（四氟硼酸盐或六氟磷酸盐）的脲或