坐标：35°53′32″N 14°31′06″E / 35.892242°N 14.518216°E / 35.892242; 14.518216
马耳他大围城战（法语：Grand Siège de Malte；西班牙语：Gran Sitio de Malta；马耳他语: L-Assedju l-Kbir）发生于1565年，这一年奥斯曼帝国入侵马耳他岛，受到医院骑士团的抵抗。医院骑士团的骑士、在西班牙帝国援军和当地平民的协助下取得了这场围城战的胜利。这是历史上最为血腥和激烈的围城战之一，亦是十六世纪欧洲最值得称道的事件之一。伏尔泰也说过：“没有什么比马耳他之围更有名了。”马耳他之围打破了欧洲人心中奥斯曼帝国不败的神话，并标志着西班牙在地中海的霸权时代的开始。
这场围城战是西方基督教联盟和奥斯曼帝国地中海争霸的高峰，这场争霸包括此前1551年奥斯曼海军将领德拉古特对马耳他的攻击和1560年基督教联盟海军在杰尔巴岛战役（英语：Battle of Djerba）的惨败，以及之后1571年决定性的勒班陀战役。
1522年，苏莱曼一世经过长达六个月的罗得岛之围，终于成功迫使医院骑士团撤出罗得岛。由1523年至1530年，骑士团一直未能找到一个固定基地，只能四处迁徙。最后，骑士团以每年须向西西里总督缴纳一只猎鹰和在诸圣节举行弥撒为代价，从神圣罗马帝国皇帝查理五世的手上取得马耳他岛和哥佐岛。1530年10月26日，大团长Philippe Villiers de L'Isle-Adam率领其手下在马耳他岛登陆，骑士团自此以马耳他骑士团之名闻名于世。查理五世又要求骑士团派兵驻守位于北非海岸的的黎波里，当时这座城市仍处于奥斯曼帝国的盟友，巴巴里海盗的控制范围以内，骑士团勉为其难答应皇帝的要求。
马耳他岛在当时只是一个不毛的小岛，但很快地骑士团便将马耳他岛建设成一个海军基地。马耳他岛位于地中海中央，是连接东西地中海的关键战略要道，正值在1540年代和1550年代巴巴里海盗在西地中海的劫掠日渐增加，该岛更为重要。巴巴里海盗在德拉古特的率领下对中地中海的基督教国家构成很大威胁，而骑士团持续与之对抗。1551年，德拉古特与奥斯曼海军出动一万兵力围攻马耳他，但数日后德拉古特便解围转往邻近的哥佐岛。在哥佐岛，德拉古特炮轰Cittadella城多日，哥佐岛的骑士团长官认为抵抗只是徒劳无功，决定开城投降。海盗洗劫该城镇，并掠走大部分哥佐岛的居民（约五千人）。之后海盗驶往的黎波里，攻下骑士团在当地的据点。大团长预料奥斯曼人将在一年内再度入侵，因此下令加强马耳他的城防，包括加固位于比尔古的Fort Saint Angelo，以及分别在森格莱阿和Mount Sciberras（位于瓦莱塔）兴建城堡。两座新城堡只用短短六个月时间便在1552年完工。在日后的围城中，这三座城堡发挥很大作用。
之后数年局势相对平静，但穆斯林与基督徒之间的私掠战仍然持续。1557年骑士团选出让·德·瓦莱特为大团长，他继续劫掠非基督徒的船只，在大团长任内他的船队总共俘虏三千多名穆斯林和犹太人为奴。与此同时，德拉古特的海盗对基督教强权构成很大威胁，多次侵袭西班牙沿岸，因此西班牙国王腓力二世在1559年组织五十年以来最大规模的海上远征驱逐的黎波里的海盗。这场远征出动54艘桨帆船和14000人，骑士团亦有参与其中，但最终在1560年5月的杰尔巴岛战役以惨败告终。基督教联军被奥斯曼海军奇袭，损失多达一半船只。杰尔巴岛战役沉重打击基督教联盟，标志奥斯曼的地中海霸权达到顶点。
经过杰尔巴岛战役一役，毫无疑问奥斯曼将会再次进攻马耳他。1560年8月，让·德·瓦莱特下令所有骑士团修会作好准备，一旦发出召集令，便要返回马耳他。土耳其人没有在基督教舰队惨败后立即乘胜追击入侵马耳他，此举让西班牙获得宝贵的五年时间重建海军。与此同时，西班牙人继续偷袭土耳其人的船队。1564年中，骑士团的船长马图林·罗梅加斯俘获不少大商船，其中一艘属奥斯曼宫廷首席太监所有，又俘虏很多达官贵人，包括开罗总督、亚历山大总督以及苏莱曼一世的女儿的前看护。苏莱曼一世在1564年底下定决心要彻底消灭骑士团。1565年初让·德·瓦莱特从部署在君士坦丁堡的间谍网得知入侵迫在眉睫，随即向教皇庇护四世和西班牙的腓力二世寻求援助。腓力二世下令西西里总督加西亚·阿尔瓦雷斯·德·托莱多和奥索里奥（García Álvarez de Toledo y Osorio）全力支援马耳他骑士团，加西亚随即前往马耳他视察当地防务，并向骑士团保证如有需要会派出援军。面对将临的奥斯曼入侵，骑士团全力备战，加强城防，储备补给，又将没有能力作战的人送往西西里。
奥斯曼远征舰队于1565年3月22日自君士坦丁堡启航，根据骑士团历史学家Giacomo Bosio记载，舰队总共有193艘船只，当中包括131艘桨帆船、7艘加利兹帆船（小桨帆船）及4艘加莱赛战船（大桨帆船），其余是运输船。同时代的西西里总督Don Garcia亦给出类似数字。
流浪诗人Francisco Balbi di Correggio当时以钩铳手身份在西班牙军队服务，则给出以下数字：
骑士Hipolito Sans估计奥斯曼远征军有48000人，但目前仍未清楚他的估算有多大程度参照Balbi的数字，其他同时代的作家给出远低于前者的数字。大团长瓦莱特在围攻开始四天后曾写信给腓力二世，表示：“登陆的士兵有15,000至16,000人之间，包括最少7,000钩铳手，其中有4,000土耳其新军和3,000西帕希骑兵”。在围攻一个月后，他在一封给德意志修会的信写道：“这支舰队有250艘各式船只，我们对敌军最接近的估计为40,000人。”250艘的数字远高于其他估算。而负责联络西西里的Vincenzo Anastagi队长则在一封信上表示敌军只有22,000人，多封同期的信都给出相近的数字。Bosio估计有30,000人，与Balbi的记载相近，其他早期的记载都给出相同数字。
在奥斯曼人抵达前，瓦莱特下令收割所有谷物，包括尚未成熟的小麦，令敌军在当地得不到任何粮食供应。骑士团又用草药和动物死尸在所有水井下毒。
奥斯曼人在5月18日黎明抵达，但没有立即登陆。第一场战斗在5月19日发生。一天后，奥斯曼舰队停靠在南部沿海。
