室町幕府，也称足利幕府，是日本历史上第二个幕府政权，由足利尊氏于1338年开设，终于1573年，其间共经历16代室町征夷大将军（由于第10和12代将军是同一人，所以有说是15代）。室町幕府虽然长达二百多年，但有一半时间国家处于战乱之中，幕府并无能力去控制拥兵自重的大名，日本步入长达一个半世纪的战国时代。
镰仓幕府后期，幕府内部势力动摇，天皇暗中决定推翻幕府的统治。正中元年（1324年），后醍醐天皇的倒幕计划被察觉从而失败。元弘元年（1331年），天皇再次起兵，但又一次遭到失败，并被流放到隐岐（现在日本岛根县隐岐岛），光严天皇作为傀儡被幕府拥立。此时，拥护流亡后醍醐天皇的势力，如皇子护良亲王和武士楠木正成等，与幕府的军队展开了战斗。幕府内部北条氏的御家人也开始反对幕府。足利尊氏就是其中较有实力的一方，他最初开始带领幕府军与反对者战斗，后来才倒戈支持天皇。元弘3年，镰仓幕府灭亡。后醍醐天皇迫使光严天皇退位，废止摄政、关白的制度，自己准备开始亲政，是为建武新政。然而，这些举措触动了武士阶级的利益，造成了他们的不满。足利尊氏借讨伐幕府残余势力，出兵关东，平定了这次叛乱之后，以讨伐新田义贞为名义，于次年攻入京都。足利尊氏在与保皇派楠木正成等人的战斗中一度失败，但后来建武3年又再度攻陷京都，拥立光明天皇、幽闭了后醍醐天皇。不久，后醍醐天皇从京都逃到吉野（今奈良县吉野町），宣称自己的正统。这时，日本出现了两位天皇，南北朝时代开始。1338年，足利尊氏被北朝任命为征夷大将军，于京都开设幕府。由于后来第三代将军足利义满在京都室町建造了花之御所作为政务场所，因此足利幕府被称呼为“室町幕府”。
随着南朝军事统帅楠木正成和新田义贞战死，即使后来出现了观应之乱，甚至足利尊氏之子足利直冬也起兵反抗足利尊氏，最终还是北朝获得了胜利。室町幕府前两代将军主要着力于国内战乱、平衡各地守护的势力。到了足利义满时，他进一步削弱势力过于强大的地方势力，例如山名氏，室町幕府的统治得到巩固。足利义满不仅担任征夷大将军，还兼任了公家顶级官职太政大臣。
足利义满时期，室町幕府的行政机构也大体形成，大体上沿袭了镰仓幕府的形式。管领主要辅佐将军职务。其中，政所主要管理财政，侍所则负责京都内外警卫和刑事裁决。管领由细川氏、斯波氏和畠山氏轮流担任，是为“三管领”，而侍所长官则由赤松氏、一色氏、山名氏和京极氏担任，是为“四职”，幕府核心由“三管四职”构成。
在地方行政上，室町幕府在镰仓设立镰仓府，最初足利尊氏三子足利基氏任镰仓公方（关东公方）。镰仓府在行政、司法、军事方面具有相对的独立性。关东公方的执事称为关东管领，由上杉氏世袭。此外，还设有探题，如奥州探题、九州探题、羽州探题，并在各令制国设守护，在庄园设置地头，加强对地方的管理。
经济上，室町幕府在各地分散地设立公方御料所和政所御料所，作为其直辖领地，由足利氏的谱代家臣代管，征收年贡。幕府也向各地守护、地头课税。此外，幕府还在交通要道征收关税。在足利义满的时期，幕府开始在京都对高利贷行业征收土仓税，对酿酒行业征收酒屋税。
日本与明朝的对外贸易也是室町幕府的重要财政收入来源。中国的元末明初时期，九州和濑户内海地区的武装商人集团也从事对外贸易，不过在商业不顺利的情况下，他们就变为海盗（倭寇），骚扰中国和朝鲜沿海地区。明朝建立后曾派出使者，要求室町幕府禁止倭寇。应永4年（1401年），足利义满下令九州探题，要求禁止倭寇，同时向明朝派出使者，建立邦交。足利义致在致明成祖朱棣的书信中自称“日本国王臣源”，朱棣则在国书中称呼足利义满为“日本国王源道义”。应永11年（1404年），双方就勘合贸易达成协议，幕府从中得到大量经济利益。后来，一些守护大名逐渐掌握了勘合贸易的实际权力。天文20年（1551年），当时掌控勘合贸易的大内氏灭亡，勘合贸易中断，此时倭寇又开始了活动，直到后来丰臣秀吉下令禁止。
随着诸如镰仓府等地方势力的发展，室町幕府与各地势力矛盾日益激化。1438年，足利义教出兵讨伐足利持氏，史称永享之乱。嘉吉元年（1441年），“四职”之一的赤松满祐刺杀足利义教。尽管他很快就被幕府方面消灭，但是室町幕府的权威却降低了。这一事件被称为嘉吉之乱。同时期，各地的农民也发生了暴动，在日本史上称为土一揆。幕府被迫发布《德政令》。
第八代将军足利义政尽管在艺术上有所成就（建立了银阁，促进了“东山文化”），却在政治上因为继承人的问题，在应仁元年（1467年）造成了应仁之乱。各地守护势力日益发展，夺取了幕府在各地的庄园。幕府的势力逐渐缩小到京都及周边山城国一地。京都由于内战，遭到了严重的损毁。各地大名的军事实力也不断加强，各自割据一方。日本陷入长达一个半世纪的全国性混战，史称战国时代。
在这一时期，幕府将军境遇惨淡，甚至成为大名的傀儡。永禄8年（1565年），被松永久秀和三好三人众视为眼中钉的第十三代幕府将军足利义辉被松永久秀和三好三人众所弑杀。
永禄11年（1568年），当时实力雄厚的织田信长扶植长期流亡在外的足利义辉之弟足利义昭成为第十五代幕府将军，挟其为傀儡以号令天下。足利义昭并不甘心作织田信长手中的傀儡，后来暗中联络各地势力大名，意图挑战织田信长的权威，导致他于天正元年（1573年）被后者流放赶出京都。室町幕府至此灭亡。虽然足利义昭被织田信长流放，但他依旧保有“征夷大将军”的名义直至1588年他辞去此职位。故而也有人主张室町幕府的灭亡时期应为1588年而非1573年。
第1代：足利尊氏
（1338年 - 1358年）
第2代：足利义诠
（1358年 - 1367年）
第3代：足利义满
（1368年 - 1394年）
第4代：足利义持
（1394年 - 1423年）
第5代：足利义量
（1423年 - 1425年）
第6代：足利义教
（1429年 - 1441年）
第7代：足利义胜
（1442年 - 1443年）
第8代：足利义政
（1449年 - 1473年）
第9代：足利义尚
（1473年 - 1489年）
第10代：足利义材1
（1490年 - 1493年）
第11代：足利义澄
（1494年 - 1508年）
第10代：足利义稙1
（1508年 - 1521年）
第12代：足利义晴
（1521年 - 1546年）
第13代：足利义辉
（1546年 - 1565年）
第14代：足利义荣
（1568年）
第15代：足利义昭
（1568年 - 1588年）
