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双脱氧链终止法
✍ dations ◷ 2025-04-03 16:45:02 #双脱氧链终止法
双脱氧链终止法(英语:dideoxyribonucleotide [簡稱 dideoxy] chain-termination method),又称桑格法(英语:Sanger method),为一种常用的核酸测序技术,用于DNA分析,由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术,为人类基因组计划所使用主要测序方法。双脱氧链终止法采用DNA复制原理。
Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物及DNA聚合酶等。
测序反应的核心就是其使用的ddNTP:由于缺少3'-OH基团,不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力,这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外,这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团,因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应,每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型萤光(或放射性同位素)标记的ddNTP(即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP)。
透过这样的配置,在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止,并形成不同长度的DNA片断。这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道,每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP)掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)DNA序列,从而得到该目标片断的碱基排列顺序。如图A所示,该DNA片断的序列顺序为TAGGCTTCGTA。随着Sanger测序技术的发展,ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同萤光基团所标记,而这些萤光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长,因而在光学上表现为不同的颜色。因此,测序反应可以在一个体系中进行,满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。如图B所示,原本四个不同的测序反应被单一测序反应所取代。桑格法操作简便,因此被广泛使用,在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用,用于人类基因组计划等项目。
基于毛细管电泳技术,Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行,商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段,且对重复序列和多聚序列的处理较好,序列准确性高。但是,这类测序仪在24h内可测定的DNA分子数一般不超过10,000个,通量较低,每碱基测序成本较高,不适合大规模平行测序。其中ABI的3500Dx系列最近获得美国FDA、欧盟与中国SFDA批准,成为第一台进入临床使用的基因测序仪。
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