双脱氧链终止法

✍ dations ◷ 2025-06-28 05:46:50 #双脱氧链终止法
双脱氧链终止法(英语:dideoxyribonucleotide [簡稱 dideoxy] chain-termination method),又称桑格法(英语:Sanger method),为一种常用的核酸测序技术,用于DNA分析,由英国生物化学家弗雷德里克·桑格于1977年发明。双脱氧链终止法与化学降解法以及其衍生方法统称为第一代DNA测序技术,为人类基因组计划所使用主要测序方法。双脱氧链终止法采用DNA复制原理。 Sanger测序反应体系中包括目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)、双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)、测序引物及DNA聚合酶等。 测序反应的核心就是其使用的ddNTP:由于缺少3'-OH基团,不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力,这些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。此外,这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基团,因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到。早期基于Sanger法的测序设置了四个平行的测序反应,每一个反应中分别包括目标片段、DNA聚合酶、测序引物、四种dNTP和一种特定类型萤光(或放射性同位素)标记的ddNTP(即不同的反应中分别为ddATP、ddGTP、ddCTP及ddTTP)。 透过这样的配置,在不同的反应中DNA链将会分别在A、G、C及T位中止,并形成不同长度的DNA片断。这些片断随后可被凝胶电泳分开并显示出来。变性丙烯酰胺电泳有四个泳道,每个泳道对应一种碱基。电泳结束后通过放射自显影或紫外显影可读出X光片或凝胶影像。图像中的每一个暗带表示一个双脱氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP)掺入后链终止的DNA片段的结果。四个泳道之间的不同暗带的相对位置可以用来读取(从底部到顶部)DNA序列,从而得到该目标片断的碱基排列顺序。如图A所示,该DNA片断的序列顺序为TAGGCTTCGTA。随着Sanger测序技术的发展,ddNTP的标记技术有了很大的提高。不同种类的ddNTP可以被不同萤光基团所标记,而这些萤光基团具有相同的激发波长和不同的发射波长,因而在光学上表现为不同的颜色。因此,测序反应可以在一个体系中进行,满足了业界对测序速度、自动化及通量不断提高的要求。如图B所示,原本四个不同的测序反应被单一测序反应所取代。桑格法操作简便,因此被广泛使用,在其基础上衍生出荧光自动测序技术等。基于荧光标记和双脱氧链终止法的荧光自动测序仪被广泛使用,用于人类基因组计划等项目。 基于毛细管电泳技术,Sanger测序现在已经可以在高度自动化的测序仪中进行,商用的产品包括Life Technologies的3130xL、3730xL、3500Dx与3500Dx xL测序仪及Beckman的GeXP遗传分析系统等。这类系统最长可测定600-1000bp的DNA片段,且对重复序列和多聚序列的处理较好,序列准确性高。但是,这类测序仪在24h内可测定的DNA分子数一般不超过10,000个,通量较低,每碱基测序成本较高,不适合大规模平行测序。其中ABI的3500Dx系列最近获得美国FDA、欧盟与中国SFDA批准,成为第一台进入临床使用的基因测序仪。

相关

  • 双链DNA反转录病毒双链去氧核糖核酸逆转录病毒(ds-DNA RT)是巴尔的摩病毒分类系统中的第七类病毒(Group VII)。这类病毒一般不被认为是DNA病毒(该分类中的Group I&II),而被认为是逆转录病毒(该分类的G
  • 胆囊炎胆囊炎(Cholecystitis)是指发生于胆囊的炎症,症状包括右上腹部疼痛、恶心、呕吐、偶有发烧。多半在急性胆囊炎之前会有胆绞痛(英语:Biliary colic)的症状。但胆囊炎造成的疼痛会比
  • 自然神论自然神论(英语:deism)是17到18世纪的英国和18世纪的法国出现的一个哲学观点,主要是回应牛顿力学对传统神学世界观的冲击。这个思想认为虽然上帝创造了宇宙和它存在的规则,但是在
  • 全色盲色盲(英语:Color blindness),又称色觉辨认障碍(英语:Color vision deficiency),是指看见颜色及辨别颜色的能力减退的状况。色盲有可能造成学习困难 ,购买水果、挑选衣物,及辨识交通号
  • 射精管射精管(ejaculatory ducts)是人体内输送精子的生殖管道的一部分,由输精管末端与精囊腺的排泄管汇合而成。与输精管相同,人体有一对射精管,在射精过程中起着重要的作用。精子是由
  • 微技术微技术(英语:Micro-technology)包含了微机电感测和控制、驱动元件制程开发技术、微机电系统整合技术、射频(RF MEMS)、光学(Optical MEMS)、生物医学(Bio MEMS)、电脑与周边(Compute
  • 哈尔滨医科大学哈尔滨医科大学,简称哈医大,位于黑龙江省哈尔滨市,是中国最早成立的医科大学之一,中西部高校基础能力建设工程院校。1926年9月,中国医学先驱伍连德博士创建哈尔滨医学专门学校,即
  • 暑热压力指数暑热压力指数(又称湿黑球温度)是反映温度的综合指标,用于量度气温、湿度、辐射热对人体的影响,常用于职业安全、体育和军事方面。国际标准化组织通过ISO 7243标准,采用暑热压力指
  • 伯克氏菌属等伯克氏菌属,或伯克氏菌,又译伯克霍尔德菌(学名:Burkholderia),是伯克氏菌科的一个属,这个属下最出名的有鼻疽伯克氏菌(B. mallei),是一种会在马或其他相关动物身上引起马鼻疽的病菌;
  • 同源异形盒结构 / ECOD同源(异形)框(英语:Homeobox),或称“同源匣”是某些影响动物、真菌及植物发育的基因所拥有的一段DNA序列,拥有同源框的基因称作同源异形基因,统称同源异形基因家族。这段