DOS API最初是86-DOS（英语：86-DOS）中的应用程序接口（API），并也被MS-DOS/PC-DOS及其他DOS兼容操作系统使用。大多数对DOS API的调用是使用中断21h（INT（英语：INT (x86 instruction)） 21h）。在调用INT 21h时，在AH 寄存器中带有子函数号，其他寄存器中带有其他参数，从而调用各个DOS服务。DOS服务包括键盘输入、视频输入、磁盘文件访问、执行程序、内存分配及其他事务。在1980年代后期，围绕DOS保护模式接口（英语：DOS Protected Mode Interface）（DPMI）的DOS扩展器允许程序在16位或32位的保护模式下运行，并仍可访问DOS API。
在86-DOS和MS-DOS 1.0中的原始DOS API在设计上与CP/M兼容。文件访问使用文件控制块（英语：file control block）（FCB）。在MS-DOS 2.0中的DOS API大大扩展了数个Unix概念，包括使用文件描述符、分层目录和设备I/O控制的文件访问。DOS 3.1中添加了网络重定向器（英语：network redirector）的支持。MS-DOS 3.31中，INT 25h/26h函数被增强以支持大于32MB的硬盘。MS-DOS 5添加了使用高端内存块（英语：upper memory blocks）（UMB）的支持。在MS-DOS 5之后，连续、独立发布的DOS没有改变DOS API。
在Windows 9x，DOS通常作为引导加载程序加载受保护模式的操作系统和图形外壳。DOS通常从一个DOS虚拟机（英语：virtual DOS machine）（VDM）访问，但也可以不加载Windows而直接启动到实模式的MS-DOS 7.0。DOS API已增强国际化和长文件名支持，尽管长文件名支持仅在VDM中可用。随着Windows 95 OSR2，DOS被更新到7.1，添加了FAT32及对其DOS API的支持。Windows 98和Windows Me也实现了MS-DOS 7.1 API，尽管Windows ME本身自称为MS-DOS 8.0。
Windows NT及基于它的系统（例如Windows XP和Windows Vista）不是基于MS-DOS，但也可使用一个虚拟机——NTVDM（英语：NTVDM）处理DOS API。NTVDM将DOS程序在虚拟8086模式（Intel 80386及更高处理器上可在保护模式下进行实模式的仿真）模式下运行。NTVDM支持DOS 5.0 API。面向Linux的DOSEMU（英语：DOSEMU）使用类似的方法。
