乙酰胆碱（英语：Acetylcholine, ACh，分子式CH3COOCH2CH2N+（CH3）3）为中枢及周边神经系统中常见的神经传导物质，于自主神经系统及体运动神经系统中参与神经传导。乙酰胆碱由轴突末梢释出之后，会穿过突触间隙和突触后神经元或运动终板的细胞膜上之受体结合。
在体运动神经系统，乙酰胆碱在神经肌肉连接处是控制肌肉的收缩；于副交感神经，乙酰胆碱为节前及节后神经释出的神经传导物质；于交感神经，乙酰胆碱则为节前神经释出的神经传导物质。乙酰胆碱的作用因被乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase；AChE）分解而中止。乙酰胆碱是自主神经系统（ANS）中许多神经递质中的一个。它同时作用于周边神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）上，并且是躯体神经系统运动中，使用的唯一的神经递质。乙酰胆碱也是所有自主神经节的主要神经递质。
在心脏组织中的乙酰胆碱具有抑制神经传递的效果，从而降低心脏速率，然而在骨骼肌神经肌肉接头处，乙酰胆碱也表现为一种兴奋性神经递质。
乙酰胆碱于1867年得到首次报导。1914年，亚瑟·J·埃文斯（Arthur J. Ewins）首次从自然界中提取得到乙酰胆碱。1921年，奥托·洛威（Otto Loewi）通过实验证明乙酰胆碱是一种神经递质。
胆碱能神经（英语：Cholinergic neuron）中，乙酰胆碱是通过乙酰辅酶A与胆碱经胆碱乙酰转移酶（英语：Choline acetyltransferase）催化合成的。
在阿兹海默症患者体内能观察到乙酰胆碱不足的现象。重症肌无力的病理原理即乙酰胆碱的受体被抗体封锁，令乙酰胆碱无法与受体结合发挥作用。利用乙酰胆碱受体激动剂类药物能治疗阿兹海默症与重症肌无力。
如果吸入过量乙酰胆碱，可能令心脏反应过量，引致心脏过度收缩，无法放松，引致心脏麻痹致死。
神经性毒剂与有机磷制剂会导致人体内乙酰胆碱堆积，进而产生毒性。
