TA克隆

✍ dations ◷ 2024-10-06 04:30:28 #TA克隆

TA克隆（TA cloning）是一种免用限制酶的亚克隆手段，其操作不仅比传统的亚克隆简单，而且耗时也较短。TA克隆的关键在于载体和目的基因末端的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互补配对。载体和目的基因进行上述配对之后，用DNA连接酶即可实现它们之间的共价连接。一般用PCR来制造目的基因。PCR中所用的Taq酶无3'-5'端外切活性，容易在3'端额外加上一个腺嘌呤（A）。因而PCR产物两条链3'端一般都多出一个腺嘌呤。如果PCR引物的5'端含有鸟嘌呤（G）的话，能使得3'端加上腺嘌呤的几率最大化。值得注意的是，制造用于TA克隆的目的基因的DNA聚合酶不能有3'-5'外切活性，否则产物的3'端不会多出一个额外的腺嘌呤。首先，将想要使用的载体用能产生平滑末端的限制酶线性化。之后，用末端转移酶在其末端加上一个2',3'-双脱氧三磷酸胸苷（ddTTP）。使用ddTTP才能确保只在末端加上一个胸腺嘧啶残基。胸腺嘧啶残基会被加到3'端上。一般市面上的TA克隆试剂盒中会附有一系列的可直接用于TA克隆（即3'端有一个额外的胸腺嘧啶）的载体。TA克隆中除了切开载体之外，都不需要使用限制酶，因而其操作相比传统亚克隆手段更简单快速。实验者也没有必要在设计引物的时候加上限制酶位点，因而节约了时间和金钱。另外，如果因为没有合适的酶切位点而无法进行传统的亚克隆时，TA克隆就可以作为一种替代方案。TA克隆的主要缺陷在于目的基因有50%的概率以相反方向被植入载体中。此外，通常情况中，TA克隆中的目的基因末端会多出一个腺嘌呤，而载体末端会多出一个胸腺嘧啶。

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