柱色谱法

✍ dations ◷ 2025-06-08 12:38:20 #色谱法,实验室技术

柱色谱法(英语:Column chromatography,又称为柱层析,俗称过柱子)是一种制备性色谱(Preparative chromatography),在化学中是最为常用的从混合物中分离纯净物的分离方法。不同蛋白质具不同大小、电荷、附着力,这些差异可以帮助分离从毫克到公斤级别的产物。柱色谱的主要优点是相对的低成本和可处理的固定相,选用的固定相可以避免重复利用的交叉污染和固定相的分解。

常见的制备性色谱柱是直径5mm至50mm的管状玻璃仪器,高5mm至1m,底部有旋塞,柱体底部间通常塞有多孔玻璃块或玻璃纤维以支撑填料。色谱柱的装填主要有两种方法:

固定相装填完毕后,通常在其顶端铺上一小层硅藻土、玻璃纤维或棉花等材料,用来保护固定相顶层的形状不被流体搅乱。将液面调节至固定相顶端以上,硅藻土顶端附近,小心滴加含有待分离物质的溶液。溶剂自柱色谱上口补充,同时打开下旋钮开始洗脱。分离过程中必须保持液面在固定相顶端以上,否则将会出现气泡和裂缝。如果发生干柱,吸附在固定相中的产物可能很难冲洗下来,需拆下使用溶剂溶解,造成时间上的消耗和产物上的损失。由于分离时间通常较长,有时在柱顶加上一溶剂球,或装满溶剂的分液漏斗,以保持液面可以持续高于柱顶一段时间,而不必一直在旁值守。

使用一系列按次序编号的锥形瓶或试管等接收溶剂,由于各组分通过固定相速度的差异,流出时间有差别,于是不同组分被分离到不同编号的容器中。通过旋转蒸发等手段浓缩产物。并且,较长时间的柱色谱分离可能耗费大量溶剂,旋蒸过后的溶剂可拿来重复使用。

对于有色物质的分离,可通过流出序列颜色判断产物位置,然而,多数情况需要借助分析性色谱的方法判断。常用的方法例如取一组流出液点板,进行薄层色谱分析,硅胶板置于紫外灯下,从产物荧光判断组分。

可同时操作数根色谱柱以提高分离效率,多通道收集器可实现区分不同组分的流出液,其原理是通过紫外-可见分光光度法或荧光光谱监控流出液的组分。已有快速制备色谱仪实现自动化的分离和组分检测。

固定相通常为吸附性的粉末状固体。最常用的固定相是硅胶,其次是氧化铝。过去也有使用纤维素的。除此之外,离子交换色谱法(英语:ion exchange chromatography)、反相色谱法、亲和色谱法、扩张床吸附(英语:expanded bed adsorption)也可用于柱色谱。固定相与待分离物质干重之比是一个评估固定相效率的重要参数,对于硅胶,这一比值在20:1到100:1之间,取决于待分离物保留因子的接近程度。

流动相或称洗脱剂,可以是单组份的纯溶剂,但更多情况下选用一定比例的混合溶剂。流动相的选择对柱色谱分离至关重要。溶剂配比或根据文献,自己尝试时则需综合考虑产物和溶剂极性等因素。极性产物能被极性溶剂洗脱,而非极性产物能被非极性溶剂洗脱。常使用薄层色谱法(TLC)测试各组分的保留因子,以确定固定相溶剂种类和配比。通常,保留因子在0.2至0.3之间较为合适,平衡了分离效率和溶剂消耗量。

流动相的流出速率影响分离的效果。较快的速率能缩短实验时间,并且减少扩散,因而使得分离效果更好。然而流速也不是越快越好,因为固定相和流动相之间平衡需要时间。范第姆特方程对影响分离效果几种主要因素进行了总结,根据此方程,流速当有一最优值。简单的柱色谱利用重力驱动洗脱,调节旋钮减慢流速,或者在柱顶加上溶剂球增加压力加快流速。需要更快的流速时,可使柱顶与泵或压缩气体(例如空气、氮、氩)相通,在液面以上加压,这种方法称为快速柱色谱(flash column chromatography)。

快速柱层析中的固定相粒径较 平时做管柱层析时所使用的颗粒 小。前者最常用的粒径为230 – 400目 (40 – 63 µm),而后者通常为70 – 230目(63 – 200 µm)。

柱色谱是化学实验室中极为耗时的步骤,以至于成为实验室工作的效率瓶颈。基于此现状,很多实验室仪器制造商,包括Biotage、Buchi、Interchim和Teledyne Isco等公司已经开发了自动化的快速柱色谱系统,称为LPLC(low pressure liquid chromatography,低压液相色谱仪,工作压力350~525 kPa或50.8~76.1 psi),以期人力投入的最小化。LPLC通常含有更昂贵的高效液相色谱(HPLC)的组件,包括梯度泵,样品注入端口,UV检测器和馏分收集器。LPLC可分离毫克至千克级的产物,对于原本需要HPLC多次进样的情况提供更廉价的解决方案。

相关

  • 第三度房室传导阻滞(3° AV Block),又称为完全性房室传导阻滞(Complete Block),指心房的激动波无法传入房室结。在此时,心室需自行发出激动波来使心室收缩。可将人工节律器植入
  • 病患患者,又称病人、病者和病患,是指医疗服务的接受者,大多用来指罹患疾病、或身体受到创伤,而需要医生和护理人员进行治疗的人;动物如遇到相同状况,也可以患者称之。但是对于不用接受
  • PfamPfam是一个蛋白质家族数据库。此数据库会利用隐马尔可夫模型进行多重序列比对以及加上蛋白脚注。Pfam中所登录的每一个蛋白质家族可以:Pfam内的蛋白质家族描述由维基百科使用
  • 让·魏森巴赫让·魏森巴赫(法语:Jean Weissenbach,1946年2月13日-),法国遗传学家。魏斯巴赫擅长于性染色体连锁遗传分析,创造共同的遗传图谱,与映射和几种疾病基因的克隆分析。由魏森巴赫领导的G
  • 马戏团马戏团(英语:Circus),一般指包括有杂技、受训过的动物、小丑、魔术及其他特技的表演,以娱乐观众为目的。桓宽《盐铁论》有“马戏斗虎”的记载。唐代马戏表演“透剑门伎”,表演者乘
  • 捕食者捕食(英语:Predation,或称猎食或掠食)是生态学中一种生物互动方式,在这种方式中,捕食者会捕食其他的生命,而这些被捕食者则称为猎物。在进食或行动的过程里,捕食者不一定会杀死它们
  • 首尔市政厅大楼坐标:37°33′59.06″N 126°58′40.16″E / 37.5664056°N 126.9778222°E / 37.5664056; 126.9778222 首尔特别市政厅(韩语:서울특별시 청사)是韩国首尔市政府的办公室所在地,
  • 善化庆安宫善化庆安宫位于台湾台南市善化区,是主祀天上圣母(妈祖)的庙宇。1997年4月2日公告为为三级古迹,后因文资法修改与行政区划调整先后改成“县定古迹”、“直辖市定古迹”。该庙据说
  • 信陵君信陵君(?-前243年),姬姓,魏氏,名无忌,中国战国时代魏国人,是魏昭王的儿子,魏安釐王同父异母的弟弟,后世亦称魏公子。信陵君是战国时代著名的政治家、军事家,魏安釐王时期官至魏国上将军,
  • 煎饼汤饭馔韩国煎饼(韩语:부침개)是一种韩国传统食品,由浸在面糊和鸡蛋液的混合物中的多种配料在平底锅中煎制而成。将小麦粉、米粉、鸡蛋和水混合,再在其中加入洋葱、韭菜、胡萝卜、