隔绝式恒温聚合酶连锁反应

✍ dations ◷ 2025-11-25 11:37:16 #聚合酶链式反应,DNA,恒温核酸复制反应

隔绝式恒温聚合酶连锁反应（insulated isothermal polymerase chain reaction, iiPCR）是一种在封闭毛细管内进行的聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)。此技术自2010年起，由瑞基海洋生物科技股份有限公司（GeneReach Biotechnology Corp.)进行优化并开发一系列设备（商品名POCKIT）与试剂上市贩售。它的核心技术利用毛细管底部单一热源加热产生热对流，使局部反应溶液历经95°C（底部）到60°C（顶部）连续温度变化而完成核酸扩增复制反应。Krishnan等人在2002年描述毛细管内的Rayleigh-Benard式热对流可以完成PCR。随后出现几种形式描述局部历经不同温度完成PCR反应之论文。甚至也提供完成此类PCR反应之产品开发原型的发表，以及这类产品的应用。

利用底部加热方式，使毛细管内形成热对流循环。历经底部95°C到顶部60°C的变化，完成PCR所需要之denature，anneal， extension三个反应阶段（动画说明）。

进行iiPCR之引子设计规则与即时聚合酶链式反应real-time PCR相似, 包含:

在iiPCR反应中建议使用 TaqMan 萤光探针. 探针设计规则如下:

成功的 PCR 反应依赖优质引子，其中因素包含:

设计引子除以上规则外，还需注意以下事项:

虽然iiPCR的反应模式与real-time PCR相同，但是因为热对流循环无法和传统PCR生降温循环类比，因此无法进行定量检测. 开发以iiPCR技术进行检测需要先进行多数阳性控制组及阴性控制组反应前后萤光量比较.若以反应前萤光量为B（Before）而反应后萤光量为A（After），两者比值A/B可以呈现核酸扩增反应过程中释放萤光染剂相对量. 经过多数阳性/阴性控制组之A/B比对，可以定出统计上显著差异之阈值. 对于待鉴定的检体，若其A/B值大于阈值则可判定为阳性，反之则为阴性。

因iiPCR的单纯反应温度特性适合进行例行性检查，而非需时时调整反应参数之研究工作. 因此开发产品时以使用者进行最少操作步骤及最不易出错的方式设计.

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