定点突变

✍ dations ◷ 2024-11-05 05:00:57 #定点突变

定点突变（Site-directed mutagenesis），经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的，所以也有人将它称为“反遗传法”。定点突变由加拿大生化学家迈克尔·史密斯发明，他与PCR发明者凯利·穆利斯在1993年共同获得诺贝尔化学奖。根据生物学，基因会发生突变，突变可以自发也可以诱发。在定点突变法之前，突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法让基因突变，这属于随机突变。而突变株必须在生物体上有所改变，才能确定有突变发生。突变位置必须利用分生或化学方法来确定。而定点突变法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的。定点突变的基本流程需要合成一个短的 DNA 引子。其包含了目标突变，并且与突变位点附近的模板 DNA 互补以与目的基因的 DNA 杂交。突变可以是一个碱基的改变（点突变），多个碱基的改变，增加或者删除。这个引物接着被一个 DNA 聚合酶延展，拷贝剩下的基因。拷贝后的基因包含了突变位点，并以载体的形式引入宿主细胞，并被复制。最后，突变将通过 DNA 测序以确保包含了目标突变。原始的单引物延展法很低效，突变产量低。产物包含了原有的非突变模板以及突变链，突变及非突变后代混合在一起。此外，模板 DNA 经过甲基化，而突变链未经甲基化，由于偏爱甲基化模板 DNA 的错配修复系统的存在，导致突变数目进一步下降。因此，人们开发了许多新方法来提高突变效率。1.以有配对错误的单股DNA分子作为引物，此引物包含想要突变的核苷酸，与载体进行退火后，转化导入细胞内。 2.DNA双股使用DNA 聚合酶来延长，宿主会产生两种质体，进行克隆转译后即得到突变一个氨基酸的蛋白质。利用分子选殖的方法，可以改变基因上的特定碱基，送入载体之后，可在宿主中表现。亦可知道特定氨基酸的改变对蛋白质和酵素的影响。

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